Издательство Медиа Сфера
Аутоантитела к рецепторам глутамата и продукты метаболизма оксида азота в сыворотке крови детей в остром периоде черепно-мозговой травмы
У детей, перенесших черепно-мозговую травму (ЧМТ) различной степени тяжести, в сыворотке крови определено содержание аутоантител (AT) к рецепторам глутамата и продуктов метаболизма оксида азота (NО) нитратов и нитритов. У всех детей отмечен рост в сыворотке крови уровня AT как к АМРА-, так и NMDA-подтипу рецепторов с 1-го по 10-й день после травмы. Наиболее высокое содержание в сыворотке крови наблюдалось для AT к NMDA-подтипу рецепторов глутамата и было характерно для детей, перенесших легкую ЧМТ (ЛЧМТ), имевших оценку состояния по шкале комы Глазго (ШКГ) 1415 баллов. Содержание AT к NMDA (NR2A)-рецепторам у детей, перенесших тяжелую ЧМТ (ТЧМТ, оценка по ШКГ 9 баллов) было ниже, чем у детей с ЛЧМТ, при этом наиболее низкий их уровень отмечался в группе детей с летальным исходом ЧМТ (ТЧМТ-2). В группе детей с ТЧМТ обнаружено многократное повышение концентрации метаболитов NО в сыворотке, что указывает на выраженную гипоксию мозга.
Травматическое поражение мозга при черепно-мозговой травме (ЧМТ) включает в себя два основных механизма: первичное повреждение мозга в результате непосредственного воздействия механической энергии и вторичное вследствие сложных и многообразных механизмов, запускаемых с момента получения травмы. Один из наиболее важных факторов, сопровождающих неблагоприятные исходы ЧМТ, гипоксия. Многочисленные клинические и экспериментальные исследования показали, что повреждение нейронов при гипоксии ишемии мозга связано с развитием патологических реакций, среди которых центральное место занимают гиперстимуляция глутаматных рецепторов, нарушение метаболизма Са2+, истощение энергетических ресурсов, образование свободных радикалов кислорода и оксида азота (NО) 18, 24, 29 . Некоторые авторы 2, 16 считают, что в основе посттравматической болезни мозга могут лежать иммунологические механизмы, в одних случаях облегчающие течение травмы мозга, в других вызывающие дополнительное повреждение ткани мозга, способствуя развитию его отека. Наиболее важное значение в посттравматических повреждениях мозга имеет потеря способности организма вовремя восстанавливать целостность гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). Имеются данные о том, что NО и продукты его метаболизма способны повышать проницаемость ГЭБ 25 , увеличивать проницаемость плазматической мембраны нейронов и вызывать ранние повреждения 8, 12 . При этом происходит повреждение структурных компонентов рецепторов глутамата, попадание их в кровь через поврежденный ГЭБ, что в свою очередь способствует активации аутоиммунных процессов 6 . Действительно, нами было показано, что при эпилепсии у детей и экспериментальной нитритной гипоксии увеличение содержания NО и нитритов приводит к возрастанию содержания аутоантител (AT) к AMPA (GluRl)-peцептopaм глутамата 4, 13, 14 . В настоящее время аутоиммунные механизмы вовлечения рецепторов глутамата в патогенез ЧМТ до конца не ясны. В связи с этим одновременное исследование уровня антител к рецепторам глутамата и суммарного содержания нитратов и нитритов, дающих представление об уровне образования NO, может способствовать получению новых данных для понимания патогенеза острого периода ЧМТ у детей. Материал и методы Обследовали 101 ребенка с диагнозом ЧМТ, госпитализированных в НИИ неотложной детской травматологии и хирургии Департамента здравоохранения Москвы в период с 2004 по 2006 г. В зависимости от тяжести состояния пациентов выделены две группы 48 детей с легкой (ЛЧМТ) и 53 ребенка с тяжелой ЧМТ (ТЧМТ). Тяжесть ЧМТ оценивали по шкале комы Глазго (ШКГ). Дети с ЛЧМТ перенесли сотрясение и ушиб головного мозга легкой степени и имели при поступлении в стационар оценку 1415 баллов ШКГ. Дети с ТЧМТ имели сочетанные повреждения; уровень нарушения сознания при поступлении составил 39 баллов ШКГ. Из 53 пациентов с ТЧМТ у 8 был летальный исход (были выделены в группу TЧMT-2), остальные 45 вошли в группу ТЧМТ-1. В качестве контрольной группы были использованы образцы крови детей, не страдающих заболеваниями ЦНС, находившихся на лечении в отделении хирургии или проходящих обследование в поликлинике ГУ НЦЗД РАМН. В сыворотке крови детей, перенесших ЧМТ, с 1-го по 10-й день после травмы определяли содержание AT, связывающихся с двумя подтипами глутаматных рецепторов (АМРА и NMDA), и суммарную концентрацию нитратов и нитритов (NOx). Для изучения возможных механизмов воздействия NO и его продуктов на содержание данных AT исследовали их уровень в цельной крови и сыворотке при добавлении токсических концентраций глутамата и NO-генерирующих соединений нитрита натрия и S-нитрозоцистеина. Уровень AT к субъединице GluR1 АМРА-рецепторов и субъединице NR2A NMDA-рецепторов глутамата определяли с помощью метода, разработанного в Институте мозга человека РАН 6 . Он основан на иммуноферментном определении сорбированных антител на глутаматсвязывающих мембранных белках или синтетических пептидах, идентичных по аминокислотному составу концевым участкам GluR1 и NR2A субъединиц глутаматных рецепторов (Глу). Определение AT проводили в сыворотке, разбавленной в 50 раз фосфатно-солевым буферным раствором, непосредственно перед проведением иммуноферментного анализа. Иммуноферментный анализ уровня AT проводили при комнатной температуре на иммунологических планшетах высокой сорбционной емкости Costar и Biohit. Оптическую плотность (ОП) измеряли при длине волны 492 нм (окраска ортофенилендиамином) и 450 нм (окраска тетраметилбензидином) на вертикальном спектрофотометре для иммунологических планшетов Униплан (Россия). Для расчета содержания AT из величин ОП каждого образца крови вычитали величину ОП лунок, не содержащих соответствующий глутаматсвязывающий пептид, и соотносили полученное значение с аналогично рассчитанной величиной ОП здоровых детей (контроль) соответствующей возрастной группы. Соотношение выражали в %, принимая за 100 значение ОП контрольной группы. Содержание метаболитов NО нитритов и нитратов в освобожденной от белка сыворотке крови определяли с помощью набора реактивов фирмы Саlbiochem, основанных на переводе нитратов с помощью нитратредуктазы в нитриты и определения нитритов по методу Грисса (соответственно протоколу фирмы-разработчика). Осаждение белков осуществляли, добавляя 50 мкл насыщенного раствора ZnS04 к 1 мл сыворотки крови, с последующим его нагреванием в течение 10 мин при 80С на водяной бане и центрифугированием при 10 000 10 мин. Количественную оценку суммарного содержания нитритов и нитратов осуществляли, измеряя ОП при l=530 нм, соотнося значения с калибровочной кривой, полученной для различных концентраций нитрата натрия. Полученные значения выражали в мкг л сыворотки крови. Результаты и обсуждение У большинства детей с ЧМТ концентрация AT как к АМРА-, так и к NМDA-подтипам рецепторов в сыворотке крови была достаточно высокой уже в 1-е сутки после ЧМТ и продолжала повышаться к 10-му дню. У детей из группы ТЧМТ-1 содержание AT к АМРА- и NMDA-подтипам рецепторов хотя и превышало их средний уровень в контрольной группе, но было меньше, чем в группе детей с ЛЧМТ. Наиболее низкий уровень AT в сыворотке крови был обнаружен в группе ТЧМТ-2 (см. таблицу). Таблица 1. Содержание антител к рецепторам глутамата в сыворотке крови детей с различной степенью тяжести черепно-мозговой травмы (в %) Примечание. * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 по сравнению с контрольной группой; # р<0,05, ## 0,01, ### p<0,001 по сравнению со значениями в группе детей с ЛЧМТ. Сравнение содержания AT к двум подтипам глутаматных рецепторов выявило, что во всех группах на протяжении всего периода наблюдения концентрация AT к NMDA-рецепторам была более высокой, чем концентрация к АМРА-рецепторам глутамата. Ранее было показано, что при эпилепсии в сыворотке крови отмечается повышенный уровень AT преимущественно к различным субъединицам АМРА-рецепторов 1, 4, 19, 28 , а при гипоксических ишемических повреждениях мозга AT к NMDA-рецепторам глутамата 3, 5, 7, 20 . Следовательно, наблюдаемое более высокое содержание AT к NMDA-рецепторам в остром периоде ЧМТ свидетельствует о развитии выраженной гипоксии ишемии мозга. Таким образом, установлено, что острый период ЧМТ у всех пациентов сопровождается гиперстимуляцией глутаматных рецепторов, преимущественно NMDA-типa. Активация NMDА-рецепторов начинается с 1-х суток и, по всей вероятности, запускается повышением содержания в синаптических щелях возбуждающей аминокислоты глутамата во время сопровождающей ЧМТ гипоксии мозга. Нельзя также исключить, что раннее повышение содержания AT в крови связано с активацией лимфоцитов, в которых так же, как и в нейронах, обнаружены NМDА-рецепторы 17, 26 . Анализ данных литературы и собственных результатов 6, 10, 1315 позволяют предположить, что само увеличение концентрации AT к антигенам мозга может иметь двойственный характер: с одной стороны это реакция на повреждение соответствующих структур мозга, с другой AT способны выполнять защитные функции. Поскольку у детей с хорошим исходом и более легкой ЧМТ уровень AT к NMDA-peцeптоpaм значительно увеличен уже в 1-е сутки, можно предположить, что подобное раннее повышение может иметь компенсаторный характер, направленный на блокаду рецептора и снижение его гиперстимуляции. Антитела могут прикрывать поверхностные структуры нейронов от лигандов, разрушающих структуру рецепторов, или способствовать активации систем внутриклеточной сигнализации, связанных с развитием компенсаторно-приспособительных реакций 1315 . Так, имеются экспериментальные данные 21 , свидетельствующие о способности AT к рецепторам глутамата оказывать защитное действие при инсульте и эпилепсии. В то же время более низкий уровень AT у детей с ТЧМТ, особенно в группе с неблагоприятным исходом, может указывать на срыв компенсаторных процессов и гибель нейронов: имеются данные о снижении содержания AT к NМDА-рецепторам глутамата в отдаленном периоде заболевания у пожилых людей с тяжелой дисциркуляторной энцефалопатией 20 и при экспериментально вызванном у крыс геморрагическом инфаркте мозга, сопровождающемся снижением экспрессии NМDА-рецепторов в мозге 3 . Проведенные нами ранее экспериментальные исследования показали, что в стимуляции продукции AT к глутаматным рецепторам существенную роль играет NO. На 23-й день после введения животным нитрита натрия, способного превращаться в NO 11 , происходило повышение содержания AT к AMPA (GluR1)-рецепторам. Повышение уровня AT имело дозозависимый характер и начиналось уже при введении нетоксических концентраций нитрита натрия 13, 14 . Определение суммарного содержания нитритов и нитратов (NOx) в сыворотке крови детей с ЧМТ позволило сопоставить уровень аутоиммунных процессов и уровень NО как показателя гипоксии в тканях (рис. 1). У детей с ЛЧМТ уровень NOх в сыворотке крови был выше, чем в контрольной группе, но значительно ниже, чем у детей с ТЧМТ. В группе ТЧМТ уровень метаболитов NО в сыворотке крови был в десятки раз выше, чем в группах контроля и ЛЧМТ. Наиболее высокий уровень продуктов метаболизма NО в сыворотке крови отмечался у детей группы ТЧМТ-2. Рисунок 1. Концентрация нитритов и нитратов (NOx) в сыворотке крови детей с легкой и тяжелой черепно-мозговой травмой. Примечание. Cветлые столбцы группа детей с ЛЧМТ (n=13), темные группа детей с ТЧМТ(n=13), контрольная группа здоровых детей (n=11). Данные представлены в Мm: * р<0,05, *** р<0,001 по сравнению с контрольной группой. Индивидуальный анализ данных показал, что при ТЧМТ, сопровождающейся летальным исходом, уровень AT к глутаматным рецепторам, особенно в 1-е сутки, был намного ниже, чем у детей с ЛЧМТ, а содержание метаболитов NO в крови оказывалось очень высоким. Приводим клиническое наблюдение. Больная П., 12 лет. Поступила с диагнозом острой ТЧМТ. Ушиб головного мозга тяжелой степени. Вдавленный перелом лобной, височной и теменной кости справа. Перелом основания передней и средней черепных ямок с очагами геморрагических ушибов преимущественно в правой височной доле. Ушиб ствола мозга. Диффузный отек мозга. Субарахноидальное кровоизлияние. Пневмоцефалия. Аспирационный синдром. Из анамнеза известно, что ребенок получил травму в результате ДТП. При поступлении состояние крайне тяжелое, с витальными нарушениями. Уровень сознания 3 балла по ШКГ, нарушения ритма дыхания, анизокория (D>S), горметония, АД 84 46 мм рт.ст., пульс 120 в минуту, диффузная мышечная гипотония. На КТ головного мозга выявлен вдавленный оскольчатый перелом височной, лобной и теменной костей справа () с переходом на основание средней черепной ямки, множественные очаги геморрагических ушибов в лобных долях, в области таламусов, в правой височной доле (); массивное субарахноидальное кровоизлияние, кровоизлияние в боковые желудочки мозга. Диффузный отек мозга со сдавлением базальных цистерн мозга (рис. 2). Рисунок 2. Компьютерная томография пациентки П-вой с летальным исходом тяжелой черепно-мозговой травмы. Примечание. На КТ головного мозга выявлен вдавленный оскольчатый перелом височной, лобной и теменной костей справа () с переходом на основание средней черепной ямки, множественные очаги геморрагических ушибов в лобных долях, в области таламусов, в правой височной доле (); массивное субарахноидальное кровоизлияние, кровоизлияние в боковые желудочки мозга. Диффузный отек мозга со сдавлением базальных цистерн мозга. По экстренным показаниям произведена операция декомпрессивная краниотомия, пластика твердой мозговой оболочки. После операции ребенок оставался в крайне тяжелом состоянии: использовалась искусственная вентиляция легких (ИВЛ), нестабильность гемодинамики. На 2-е сутки после травмы на фоне проводимого лечения развилась полиорганная недостаточность, гиперосмолярный синдром. В течение последующих суток состояние прогрессивно ухудшалось: ИВЛ, нестабильность гемодинамики с тенденцией к артериальной гипотонии на фоне высоких доз вазопрессоров, двусторонний мидриаз, диффузная мышечная гипотония, арефлексия, атоническая кома. На 6-е сутки на фоне прогрессирования сердечно-сосудистой недостаточности наступила смерть. Из выписки акта судебно-медицинского исследования: ...смерть наступила в результате множественных первичных кровоизлияний в вещество больших полушарий головного мозга, ствол мозга, подкорковые ядра; вторичных кровоизлияний в ствол мозга; отека, набухания головного мозга.... Содержание AT к NMDA-рецепторам Глу в 1-е сутки при поступлении было снижено по сравнению с контролем и соответствовало 95%. Концентрация NОх в сыворотке крови в десятки раз превышала контрольный уровень и составила 211 мкмоль л в 1-е сутки и 241 ммоль л на 6-е сутки после ЧМТ. Таким образом, чем более тяжелую травму перенесли пациенты, тем более высокий уровень продуктов NО сопровождал сниженный аутоиммунный ответ в отношении рецепторов глутамата. Более низкий уровень AT в сыворотке крови у детей с ТЧМТ может объясняться высоким уровнем токсических форм NО (двуокиси азота и пероксинитрита), реактивными формами кислорода и продуктами перекисного окисления липидов в 1-е сутки после травмы 22, 26 . Добавление токсических концентраций глутамата и NO-генерирующих соединений (нитрита натрия и S-нитрозоцистеина) к цельной крови с заведомо повышенным содержанием AT к NMDA-рецепторам приводило к снижению содержания AT к рецепторам глутамата (рис. 3, А, Б, В, Г). Подобное снижение уровня AT наблюдалось при инкубации указанных соединений с цельной кровью, а не с сывороткой. Эти данные свидетельствуют о способности токсических концентраций глутамата, NO и нитритов вызывать повышенную адсорбцию AT к рецепторам глутамата на форменных элементах крови. Отсюда следует, что наблюдаемый нами более низкий уровень AT в крови детей с ТЧМТ может быть связан со значительным образованием NО и продуктов его превращениянитритов. Рисунок 3. Уровень антител к NMDA- и AМРА-рецепторам глутамата при инкубации глутамата и NO-генерирующих соединений с цельной кровью (А и Б) и сывороткой (В и Г) в течение 1 ч. Примечание. 1 исходный уровень AT; 2 500 мкМ глутамат; 3 2000 мкМ NaNО2; 4 250 мкМ S-нитрозоцистеин, SNOC; *** р<0,001 по сравнению с контролем; n=56 для каждого столбца. Учитывая способность NО нитрозилировать SH-группы белков, входящих в состав глутаматных рецепторов, и тем самым снижать поступление Са2+ в нейроны 9, 23, 24 , можно предположить, что участие NO в стимуляции продукции AT к рецепторам глутамата в первые дни после травмы носит двойственный характер: с одной стороны, повреждает структуру плазматических мембран нейронов и вызывает повышение образования AT, с другой образование AT в начале ишемии мозга может блокировать рецепторы Глу и снизить их гиперстимуляцию. Однако накопление NО и его токсичных продуктов в дальнейшем может способствовать вторичным повреждениям нейронов. Учитывая, что большие концентрации NO приводят к массивному некрозу нейронов, вызывают сильное падение АТФ и гибель нейронов, у детей с ТЧМТ нeoбxoдимo проведение активной антиоксидантной терапии. Проведенные нами исследования уровня AT к рецепторам глутамата в остром периоде ЧМТ у детей свидетельствуют о нарушении иммунных процессов при тяжелой травме мозга и могут быть использованы в дальнейшем для разработки подходов к иммунотерапии. Работа поддержана грантом МКНТ. Литература Базарова В.Г., Гранстрем O.K., Дамбинова С.А. Уровень аутоантител к субъединицам глутаматных рецепторов и иммунологические показатели крови у больных эпилепсией. Вопр мед химии 2002; 48: 4: 381387. Ганнушкина И.В. Иммунологические аспекты травмы и сосудистых поражений мозга. М: Медицина 1974. Гаппоева М.У. Сравнительное исследование экспрессии и иммунореактивности NMDA-рецепторов при экстремальной церебральной ишемии и геморрагии мозга: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. М 2003. Глоба О.В., Сорокина Е.Г., Семенова Н.Ю. и др. Тест пароксизмальной активности в детской неврологии. В сб. статей: Успехи функциональной нейрохимии. Ст-Петербург 2003; 389402. Горюнова А.В., Базарная Н.А., Сорокина Е.Г. Динамика уровня аАТ к рецепторам глутамата у детей с хронической посттравматической головной болью. Журн неврол и психиат 2006; 106: 8: 5053. Дамбинова С.А., Изыкенова Г.А. Аутоантитела к подтипам глутаматных рецепторов маркеры функционального поражения головного мозга: их диагностическое значение для выявления пароксизмальной активности и ишемии. Журн высш нервн деят 1997; 47: 439446. Дамбинова С.А., Одинак М.М., Скулябин Д.И. и др. Лабораторные методы при эпилепсии и нарушениях мозгового кровообращении. Журн неврол и психиат 2001; 1: 5864. Пинелис В.Г., Сорокина Е.Г., Реутов В.П. и др. Влияние токсического воздействия глутамата и нитрита на содержание циклического ГМФ в нейронах и их выживаемость. Докл РАН 1997; 352: 2: 259261. Пинелис В.Г., Юрявичус А.И., Реутов В.П. и др. Влияние NО-генерирующих соединений и глутамата на внутриклеточное содержание ионов Са2+ и энергетическую функцию митохондрий нейронов мозжечка крыс. В кн.: Пурины и монооксид азота. Регуляторная функция в организме. Минск: Технопринт 2003; 9597. Полетаев А.Б. Парадоксы иммуноневрологии. Конференция Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты: Тезисы докладов. М 2005. Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Охотин В.Е., Косицын Н.С. Циклические превращения оксида азота в организме млекопитающих. М: Наука 1998. Сорокина Е.Г., Реутов В.П., Пинелис В.Г. и др. Механизм потенцирующего действия альбумина при токсическом воздействии глутамата: возможная роль окиси азота. Биол мембраны 1999; 16: 3: 318323. Сорокина Е.Г., Реутов В.П., Гранстрем О.К. и др. Возможная роль оксида азота в повреждении глутаматных рецепторов при эпилепсии. Вести национальной академии наук Беларуси. Серия медико-биологических наук 2002; 1: 1822. Сорокина Е.Г., Реутов В.П., Гранстрем O.K. и др. Изучение механизмов образования аутоантител при эпилепсии и гипоксии. Нейроиммунология 2003; 1: 2: 137138. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. М: Медицина 2002. Archelos J.J., Hartung H.-P. Pathogenic role of autoantibodies in neurological diseases. Trends Neurosci 2000; 23: 317327. Boldyrev A.A., Kazey V.I., Leinsoo T.A. et al. Rodent lymphocytes express functionally active glunamate receptors. Biochem and Biophysical Res Communication 2004; 324: 133139. Choi D.W. Glutamate neurotoxicity and diseases of the nervous system. Neuron 1998; 1: 623634. Dambinova S.A., Granstrem O.K., Tourov A. et al. Monitoring of brain spiking activity and autoantibodies to N-terminus domain of GluRl subunit of AMP A receptors in blood serum of rats with cobalt-induced epilepsy. J Neurochem 1998; 5: 20882093. Dambinova S.A., Khounteev G.A., Izykenova G.A. et al. Blood test detecting autoantibodies to N-methyl-D-aspartate neuroreceptors for evaluation of patients with transient ischemic attack and stroke. Clin Chem 2003; 49: 10: 17521762. During M.J., Symes C.W., Lawlor P.A. et al. An oral vaccine against NMDAR1 with efficacy in experimental stroke and epilepsy. Science 2000; 287: 14531460. Lewen A., Matz P., Chan P.H. Free radical pathways in CNS injury. J Neurotrauma 2000; 17: 871890. Li Chung-Yu, Chin Tig-Yu, Chueh S.-H. Rat cerebellar granule cells are protected from glutamate-induced excitotoxicity by S-nitrosoglutathione but not glutathione. Am J Physiol Cell Physiol 2004; 286: 893904. Lipton S.A., Choi Y-B., Pan Zh-H. et al. A redox-based mechanism for the neuroprotective and neurodestractive effects of nitric oxide and related-compounds. Nature 1993; 364: 626632. Mayhan W.G. Nitric oxide donor-induced increase in permeability of the blood-brain barrier. Brain Res 2000; 866: 101108. Miglio G., Varsaldi F., Lombardi G. Human T lymphocytes express N-methyl-D-aspartate receptors functionally active in controlling T cell activation. Biochem Biophys Res Commun 2005; 338: 4: 18751883. Pacher P., Beckman J.S., Liaudet L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol Rev 2007; 87: 315424. Rogers S.W., Andrews P.I., Gahring L.S. et al. Autoantibodies to glutamate receptor GluR3 inRasmussens encephalites. Science 1994; 265: 648651. White B.C., Sullivan J.M., DeGracia D.J. et al. Brain ischemia and reperfusion: molecular mechanisms of neuronal injury. J Neurological Sci 2000; 179: 133.
Отклики на статью
Издательство Медиа Сфера , 2005
Адрес: г.Москва, Дмитровское шоссе, дом 46, корп. 2
Почтовый адрес: 127238, Москва, а/я 54, Издательство Медиа Сфера
Телефоны: (495) 482-4329, 482-4118, 482-0604
source 
